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Conteúdo principal

Microscopia

Introdução aos microscópios e como eles funcionam. Cobre microscopia de campo claro, microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica.

Introdução

Se você conversar com alguns biólogos celulares e perguntar do que eles mais gostam em seu trabalho, você descobrirá que tudo se resume a uma coisa: secretamente, todos eles são loucos pelos microscópios. No fundo, o que eles realmente amam em seu trabalho é a oportunidade de sentar-se em uma sala pequena e escura durante horas, interagindo com seu tipo preferido de célula através da lente de um belo microscópio. Isso pode parecer estranho, mas é verdade que as células podem ser bem deslumbrantes, como vitrais vivos. Um dos meus exemplos preferidos é a imagem a seguir, que mostra as células de uma folha jovem de arabeta, uma pequena planta herbácea com flores, da família da mostarda.
Crédito da imagem: Carrie Metzinger Northover, Bergmann Lab, Stanford University.
Isso não é uma simples imagem da microscopia ótica, é uma imagem fluorescente de uma planta especialmente preparada, onde várias partes da célula receberam marcadores que as fizeram brilhar. Todavia, este tipo complexidade celular e de beleza estão sempre ao nosso redor, mesmo que a gente não perceba.
Você pode encontrar as células em seus padrões intricados belamente formados em qualquer planta que enxergar – na roseira de seu quintal, na grama que cresce na calçada, nas cenouras que você comeu no lanche. E não nos limitemos às plantas: camadas sofisticadas de células também podem ser encontradas na sua pele, na asa de um inseto e praticamente em qualquer tecido vivo que você quiser examinar. Nós, e o mundo que nos rodeia, somos catedrais feitas de células. Só precisamos da microscopia para apreciá-las.

Microscópios e lentes

Embora as células variem em tamanho, em geral, elas são bastante pequenas. Por exemplo, uma hemácia humana típica tem aproximadamente oito micrômetros (0,008 milímetros) de diâmetro. Para se ter uma ideia, a cabeça de um alfinete tem cerca de 1 milímetro de diâmetro, de modo que é possível alinhar aproximadamente 125 hemácias transversalmente na cabeça de um alfinete. Salvo raras exceções, as células individuais não podem ser vistas a olho nu, então, os cientistas precisam usar microscópios (micro- = "pequeno"; -scópio = "olhar") para estudá-las. O microscópio é um instrumento que amplia objetos minúsculos, produzindo uma imagem na qual o objeto aparece maior. A maioria das fotografias de células é tirada usando-se um microscópio, e essas fotografias também podem ser chamadas de microfotografias.
Considerando a definição acima, pode parecer que o microscópio é apenas um tipo de lupa. Na verdade, as lupas podem ser consideradas microscópios; como elas têm apenas uma lente, elas são chamadas microscópios simples. Os instrumentos mais sofisticados, normalmente considerados microscópios, são microscópios compostos; ou seja, eles têm múltiplas lentes. Por causa da forma com que essas lentes são organizadas, eles podem encurvar a luz para produzir uma imagem muito mais ampliada do que a de uma lupa.
Num microscópio composto de duas lentes, a organização das lentes tem uma consequência interessante: a orientação da imagem que você vê é invertida em relação ao objeto que está sendo examinado. Por exemplo, se você examinar um pedaço de jornal com a letra "e", a imagem que você verá no microscópio é “ə.” Os microscópios compostos mais complexos não produzem a imagem invertida porque eles têm uma lente adicional que "reinverte" a imagem à posição normal.
O que diferencia um microscópio comum de uma máquina poderosa usada em laboratório de pesquisa? Há dois parâmetros especialmente importantes na microscopia: ampliação e resolução.
  • Ampliação é a medida de quanto maior um microscópio (ou conjunto de lentes dentro do microscópio) consegue mostrar um objeto. Por exemplo, os microscópios óticos normalmente usados nas escolas e faculdades ampliam cerca de 400 vezes o tamanho real. Então, algo que possua 1 mm de largura na vida real terá 400 mm de largura na imagem microscópica.
  • A resolução de um microscópio ou lente é a menor distância na qual dois pontos podem estar separados e ainda ser distinguidos como objetos distintos. Quanto menor for este valor, maior o poder de resolução do microscópio e melhor a clareza e detalhe da imagem. Se duas células bacterianas estiverem muito próximas em uma lâmina, elas podem parecer um único ponto borrado num microscópio com baixo poder de resolução, mas podem parecer distintas num microscópio com alto poder de resolução.
Tanto a magnificação quanto a resolução são importantes se quisermos uma imagem clara de algo muito pequeno. Por exemplo, se um microscópio tiver alta magnificação, mas baixa resolução, tudo o que você verá é uma versão maior de uma imagem embaçada. Tipos diferentes de microscópios diferem em sua magnificação e resolução.

Microscópios de luz

A maioria dos microscópios de estudantes é classificada como microscópios de luz. Em um microscópio desse tipo, a luz visível passa pelo espécime (a amostra biológica que está sendo analisada) e é desviada pelo sistema de lentes, permitindo ao observador ver uma imagem ampliada. Uma vantagem do microscópio de luz é que ele pode ser utilizado na visualização de células vivas, assim é possível observar o comportamento normal das células (por ex., migração ou divisão).
Crédito da imagem: OpenStax Biology. Imagem modificada do original por "GcG"/Wikimedia Commons.
Os microscópios de laboratório de ensino geralmente são microscópios de campo claro, e significa que a luz visível passa através da amostra e forma a imagem diretamente, sem qualquer modificação. As formas de microscopia ótica um pouco mais sofisticadas usam truques óticos para realçar o contraste, facilitando a visualização dos detalhes das células e tecidos.
Um outro tipo de microscopia ótica é a microscopia de fluorescência, que é usada para gerar imagem de amostras que fluorescem (absorvem um comprimento de onda da luz e emitem outro). A luz de um determinado comprimento de onda é usada para excitar as moléculas fluorescentes, e a luz de um outro comprimento de onda diferente emitida por elas é coletada e usada para formar a imagem. Na maioria dos casos, a parte da célula ou tecido que queremos examinar não é naturalmente fluorescente, por isso precisa ser marcada com algum pigmento ou etiqueta fluorescente antes de ir para o microscópio.
A imagem da folha no início do artigo foi obtida usando um tipo especializado de microscopia de fluorescência chamado microscopia confocal. O microscópio confocal utiliza um laser para excitar uma fina camada da amostra e coleta somente a luz emitida pela camada de interesse, produzindo uma imagem nítida e sem interferência das moléculas fluorescentes das camadas adjacentes4.

Microscópios eletrônicos

Alguns tipos de microscopia de luz mais avançados (além das técnicas que discutimos acima) podem produzir imagens de resolução muito alta. No entanto, se você quer visualizar algo muito pequeno em uma resolução muito alta, você pode querer usar uma técnica diferente, testada e aprovada: a microscopia eletrônica.
Os microscópios eletrônicos diferem de microscópios de luz por produzirem uma imagem de uma amostra usando um feixe de elétrons em vez de um feixe de luz. Os elétrons têm um comprimento de onda muito menor que a luz visível, e isso permite que os microscópios eletrônicos produzam imagens de alta resolução melhor que as de microscópios de luz padrão. Os microscópios de eletrônicos podem ser usados para examinar não apenas a célula, mas também as estruturas subcelulares (organelas) e seus compartimentos.
Uma limitação, no entanto, é que as amostras da microscopia eletrônica devem ser colocadas sob vácuo (e normalmente são preparadas através de um processo extensivo de fixação). Isso significa que células vivas não podem ser fotografadas na microscopia eletrônica.
Crédito da imagem: OpenStax Biology. Crédito a: Imagem modificada do original por CDC/Armed Forces Institute of Pathology, Charles N. Farmer, Rocky Mountain Laboratories; Crédito b: Imagem modificada do original por NIAID, NIH; dados da escala de Matt Russell.
Na imagem acima, é possível comparar a aparência da bactéria Salmonella em uma micrografia (esquerda) com uma imagem produzida por uma microscópio eletrônico (direita). A bactéria aparece como pequenos pontos roxos na imagem do microscópio de luz, enquanto na eletromicrografia, é possível ver claramente sua forma e textura da superfície, bem como os detalhes das células humanas que as elas estão tentando invadir.
Crédito da imagem: OpenStax Biology. Imagem modificada do original por Evan Bench.
Existem dois tipos principais de microscopia eletrônica. Na microscopia eletrônica de varredura (MEV), um feixe de elétrons move-se para a frente e para trás através da superfície de uma célula ou tecido, criando uma imagem detalhada da superfície 3D. Este tipo de microscopia foi usado para realizar a imagem da bactéria Salmonella mostrada à direita, acima.
Na microscopia eletrônica de transmissão (MET), ao contrário, a amostra é cortada em fatias extremamente finas (por exemplo, usando uma borda de diamante) antes da visualização, e o feixe de elétron atravessa a fatia ao invés de percorrer sobre sua superfície5. O MET é muitas vezes usado para obter imagens detalhadas das estruturas internas das células.
Os microscópios eletrônicos, como o descrito acima, são significativamente mais volumosos e mais caros do que os microscópios óticos convencionais, e isso não é surpreendente se considerarmos as partículas subatômicas que são examinadas!

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