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Conteúdo principal

Eletroforese em gel

Uma técnica utilizada para separar fragmentos de DNA e outras macromoléculas por tamanho e carga.

Pontos Principais:

  • A eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho.
  • As amostras de DNA são carregadas nos poços (cavidades) localizados numa das extremidades de um gel, e uma corrente elétrica é aplicada para fazê-las avançar pelo gel.
  • Os fragmentos DNA estão carregados negativamente, então movem-se na direção do eletrodo positivo. Já que todos os fragmentos de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa, os fragmentos menores atravessam o gel mais rapidamente do que os maiores.
  • Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA, os fragmentos de DNA podem ser vistos como bandas, cada uma representando um grupo de fragmentos de DNA de mesmo tamanho.

Introdução

Suponha que você tenha acabado de fazer uma reação de PCR, criando várias cópias de uma região de interesse do DNA. Ou talvez você tenha feito uma clonagem de DNA, tentando "colar" um gene em um plasmídeo de DNA circular.
Agora, você quer verificar se seu PCR funcionou, ou se seu plasmídeo contém o gene certo. Que técnica você pode usar para visualizar (observar diretamente) os fragmentos de DNA?

Eletroforese em gel

A Eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA (ou outras macromoléculas, como o RNA e proteínas) com base no tamanho e carga. A eletroforese envolve a passagem de uma corrente através de um gel contendo as moléculas de interesse. Em função de seu tamanho e carga, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras.
Todas as moléculas de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa. Por essa razão, a eletroforese em gel de fragmentos de DNA faz a separação baseada apenas no tamanho. Através do uso da eletroforese, podemos ver quantos diferentes fragmentos de DNA estão presentes em uma amostra, e o quão grandes eles são em relação aos outros. Podemos também determinar o tamanho absoluto de um pedaço de DNA examinando-o ao lado de um DNA "padrão", composto de fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos.

O que é um gel?

Como o nome sugere, a gel electroforese envolve um gel: uma placa de material gelatinoso. Géis para separação de DNA são muitas vezes feitos de um polissacarídeo chamado agarose, que vem na forma de flocos secos em pó. Quando a agarose é aquecida em um tampão (água com alguns sais) e deixada para esfriar, forma um gel sólido ligeiramente mole. No nível molecular, o gel é uma matriz de moléculas de agarose que são mantidas unidas por ligações de hidrogênio e formam micro poros.
Em uma extremidade, o gel tem cavidades semelhantes a bolsos chamadas poços, onde as amostras de DNA serão colocadas:
Antes das amostras de DNA serem adicionadas, o gel deve ser colocado em uma caixa de gel. Uma extremidade da caixa é ligada a um eletrodo positivo, enquanto a outra extremidade é ligada a um eletrodo negativo. O corpo principal da caixa, onde o gel é colocado, é preenchido com uma solução tampão contendo sal que pode conduzir corrente. Embora você não seja capaz de ver na imagem acima (graças a minhas incríveis habilidades artísticas), o tampão preenche a caixa de gel até o nível em que ele mal chega a cobrir o gel.
A extremidade do gel com os poços está voltada para o eletrodo negativo. A extremidade sem poços (para a qual os fragmentos de DNA vão migrar) está voltada para o eletrodo positivo.

Como os fragmentos de DNA movem-se através do gel?

Uma vez que o gel esteja na caixa, cada uma das amostras de DNA que queremos examinar (por exemplo, cada reação de PCR ou cada plasmídeo digerido por restrição) é cuidadosamente transferida para um dos poços. Um poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de referência que contém fragmentos de DNA de comprimentos conhecidos. As escadas de DNA comerciais vêm em diferentes intervalos de tamanho, então podemos escolher uma que tenha boa "cobertura" para a faixa de tamanho esperada de nossos fragmentos.
A seguir, a caixa é ligada e a corrente começa a fluir através do gel. As moléculas de DNA têm carga negativa devido aos grupos fosfato em seus esqueletos de açúcar-fosfato, assim elas começam a se mover através da matriz de gel, para o polo positivo. Quando a energia é ligada e a corrente passa através do gel, diz-se que o gel está correndo.
As amostras de DNA são carregadas nos poços na extremidade do eletrodo negativo do gel.
A energia é ligada e os fragmentos de DNA migram através do gel (para o eletrodo positivo).
Após a corrida do gel, os fragmentos são separados por tamanho. Os fragmentos maiores estão perto da extremidade superior do gel (eletrodo negativo, onde eles começaram), e os fragmentos menores estão próximos da extremidade inferior (eletrodo positivo).
Adaptado do diagrama de Reece et al.5
Qual fragmento de DNA vai ganhar a "corrida" para o polo positivo? Pedaços curtos de DNA vão viajar através dos poros da matriz de gel mais rapidamente que os mais longos. Após o gel ter corrido por algum tempo, os pedaços mais curtos de DNA vão estar mais próximos do polo positivo do gel, enquanto os mais longos vão permanecer próximos aos poços. Pedaços muitos curtos de DNA podem correr diretamente para a extremidade do gel se forem deixados por períodos suficientemente longos (algo de que me senti definitivamente culpado!).

Visualização dos fragmentos de DNA

Uma vez que os fragmentos tenham sido separados, podemos examinar o gel e ver quais tamanhos de faixas são encontrados. Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA e depois colocado sob luz UV, os fragmentos de DNA brilham, o que nos permite visualizar o DNA presente em diferentes locais ao longo da extensão do gel.
O bp ao lado de cada número na escada indica quantos pares de base tem no comprimento do fragmento de DNA.
Uma "linha" bem definida de DNA em um gel é chamada de banda. Cada banda contém um grande número de fragmentos de DNA do mesmo tamanho e todos os que viajaram, como um grupo, para a mesma posição. Um fragmento único de DNA (ou até mesmo um pequeno grupo de fragmentos de DNA) não seria visível por si só em um gel.
Ao comparar as bandas em uma amostra à escada de DNA, podemos determinar os tamanhos aproximados. Por exemplo, a banda brilhante no gel acima tem, aproximadamente, o tamanho de 700 pares de bases (bp).

Teste seu conhecimento

Faixa mais à esquerda: escada com marcações das bandas de 3000 bp, 1500 bp e 500 bp.
Faixa 1: banda de 5000 bp.
Faixa 2: banda de 100 bp.
Faixa 3: bandas de 1500 bp e 2000 bp.
Faixa 4: banda de 500 bp.
Quatro faixas são numeradas no gel acima. (A faixa é um corredor através do qual o DNA passa assim que sai de um poço.)
Qual faixa corresponde a cada descrição abaixo?
1
2
3
4
Esta faixa contém o fragmento de DNA mais longo.
Esta faixa contém o fragmento de DNA mais curto.
Esta faixa contém um fragmento de DNA de 1500 pares de base (bp).

Explore além da Khan Academy

Quer saber mais sobre eletroforese em gel? Confira esta atividade interativa e esta simulação do LabXchange.
LabXchange é uma plataforma on-line gratuita de educação científica criada na Faculdade de Artes e Ciências de Harvard e apoiada pela Fundação Amgen.

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