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Visão geral: Clonagem de DNA

Definição, finalidade e os passos básicos da clonagem do DNA.

Pontos Principais:

Clonagem de DNA é uma técnica da biologia molecular para fazer muitas cópias idênticas de um pedaço de DNA, tal como um gene.
Num experimento típico de clonagem, um gene alvo é inserido num pedaço circular de DNA chamado do plasmídeo.
O plasmídeo é introduzido em bactérias através de um processo chamado transformação, e bactérias portadoras do plasmídeo são selecionadas utilizando-se antibióticos.
As bactérias com o plasmídeo correto são utilizadas para produzirem mais DNA do plasmídeo ou, em alguns casos, induzidas a expressar o gene e produzir proteína.

Introdução

Quando você ouve a palavra “clonagem,” você pode pensar na clonagem de um organismo inteiro, como a ovelha Dolly. Porém, o significado de clonar alguma coisa é fazer uma cópia geneticamente exata dela. Num laboratório de genética molecular, o que é clonado com maior frequência é um gene ou um pequeno pedaço de DNA.

Se sua amiga bióloga molecular disser que sua "clonagem" não está funcionando, ela quase certamente estará falando acerca da cópia de pedaços de DNA, não de estar fazendo a próxima Dolly!

Visão geral da clonagem de DNA

Clonagem de DNA é o processo de fazer várias cópias idênticas de um pedaço específico de DNA. Num procedimento típico de clonagem de DNA, o gene ou outro fragmento de DNA de interesse (talvez um gene para uma proteína humana de interesse médico) é primeiramente inserido numa peça circular de DNA chamada plasmídeo. A inserção é feita utilizando-se enzimas que “cortam e colam” DNA, e produz uma molécula de DNA recombinante, ou seja, DNA montado a partir de fragmentos de várias fontes.

Em seguida o plasmídeo recombinante é introduzido em bactérias. As bactérias contendo plasmídeo são selecionadas e cultivadas. Conforme elas se reproduzem, replicam o plasmídeo e o transmitem para seus descendentes, produzindo cópias do DNA que ele contém.

Qual a finalidade de produzir várias cópias de uma sequência de DNA num plasmídeo? Em alguns casos, precisamos de muitas cópias de DNA para realizar experimentos ou construir novos plasmídeos. Em outros, o pedaço de DNA codifica uma proteína útil, e as bactérias são usadas como "fábricas" para produção dessa proteína. Por exemplo, o gene da insulina humana é expresso em bactérias E. coli para produzir a insulina usada pelos diabéticos.

Talvez você saiba, se você tiver amigos ou familiares diabéticos, que o hormônio insulina desempenha um papel importante na saúde humana. No corpo da pessoa saudável, a insulina é produzida no pâncreas. Ela viaja através da corrente sanguínea e liga-se às células do corpo, permitindo-lhes absorver o açúcar glicose.

Numa pessoa com diabetes tipo I, as células do pâncreas que produzem insulina são danificadas ou destruídas. Pessoas com diabetes tipo I precisam injetar regularmente insulina de outra fonte para evitar níveis perigosamente elevados de açúcar no sangue (e para permitir a entrada do açúcar nas células do corpo, como combustível).

Por muitos anos, todos a insulina usada pelos diabéticos tipo I veio dos pâncreas de porcos e vacas que eram abatidos para a produção de carne. A molécula de insulina é semelhante entre os seres humanos, porcos e vacas, então a insulina de porco ou vaca pode substituir a insulina humana nos corpos dos diabéticos tipo I.

Na década de 1980, os cientistas começaram a desenvolver novas técnicas de produção de insulina humana utilizando bactérias Escherichia coli (E. coli). Eles basicamente transformaram as bactérias em pequenas fábricas de insulina. Essa insulina recombinante, ou insulina produzida pela combinação de DNA de várias fontes (humanas e bactérias), atualmente é o tratamento básico usado para diabéticos tipo I.

Etapas da clonagem do DNA

A clonagem do DNA é utilizada para várias finalidades.Como exemplo, vejamos como a clonagem do DNA pode ser utilizada para sintetizar uma proteína (como a insulina humana) nas bactérias. As etapas básicas são:

Cortar e abrir o plasmídeo e "inserir" o gene. Esse processo baseia-se em enzimas de restrição (que cortam o DNA) e na DNA ligase (que une/cola o DNA).
Inserir o plasmídeo na bactéria. Utilizar a seleção por antibiótico para identificar as bactérias que pegaram o plasmídeo.
Cultivar lotes de bactérias portadoras de plasmídeo e usá-las como "fábricas" para fazer a proteína. Colher a proteína das bactérias e purificá-la.

Vamos dar uma olhada mais detalhada em cada etapa.

1. Cortando e colando DNA

Como pedaços de DNA de diferentes fontes podem ser unidos? Um método comum utiliza dois tipos de enzimas: enzimas de restrição e DNA ligase.

Um enzima de restrição é uma enzima cortadora de DNA que reconhece uma sequência alvo específica e corta o DNA em dois pedaços neste sítio ou próximo a ele. Muitas enzimas de restrição produzem extremidades cortadas com saliências curtas de fita simples. Se duas moléculas tiverem saliências correspondentes, elas podem parear bases e permanecer juntas. Contudo, elas não irão se combinar para formar uma molécula de DNA intacta até que sejam unidas pelo DNA ligase, que sela as lacunas do eixo do DNA.

Nossa meta na clonagem é inserir um gene alvo (p.e., para insulina humana) num plasmídeo. Usando uma enzima de restrição cuidadosamente escolhida, digerimos:

O plasmídeo, que tem um único local de corte
O fragmento do gene alvo, que tem um sítio de restrição (de corte) próximo a cada extremidade

Então, combinamos os fragmentos com DNA ligase, que os une para fazer um plasmídeo recombinante contendo o gene.

2. Transformação e seleção bacteriana

Os plasmídeos e outros DNA podem ser introduzidos nas bactérias, como as inofensivas E. coli utilizadas em laboratório, num processo chamado transformação. Durante a transformação, é dado um choque (por exposição a alta temperatura, por exemplo) a células bacterianas especialmente preparadas que as encoraja a incorporar DNA estranho.

Um plasmídeo geralmente tem um gene de resistência aos antibióticos, que permite que as bactérias sobrevivam na presença de um antibiótico específico. Assim, as bactérias portadoras de plasmídeo podem ser selecionadas em placas com nutrientes contendo o antibiótico. As bactérias sem plasmídeo morrerão, enquanto bactérias portadoras de plasmídeo podem viver e reproduzir-se. Cada bactéria sobrevivente dará origem a um grupo pequeno, como um ponto, ou colônia, de bactérias idênticas em que todas carregam o mesmo plasmídeo.

Nem todas as colônias irão necessariamente conter o plasmídeo certo. Isso acontece porque, durante uma ligação, fragmentos de DNA nem sempre ficam "colados" exatamente da maneira que queremos. Em vez disso, devemos coletar o DNA de várias colonias e ver se cada uma contém o plasmídeo certo. Métodos como digestão por enzima de restrição e PCR/RCP são comumente usados para checar os plasmídeos.

3. Produção de proteína

Uma vez que encontramos uma colonia de bactérias com o plasmídeo certo, podemos cultivar uma grande cultura de bactérias portadoras do plasmídeo. Nesse momento, damos às bactérias um sinal químico que as instrui a produzir a proteína alvo.

As bactérias servem como mini "fábricas," produzindo grandes quantidades de proteína. Por exemplo, se nosso plasmídeo continha o gene da insulina humana, as bactérias começariam a transcrição do gene e a tradução do RNAm para produzir muitas moléculas da proteína insulina humana.

Os seres humanos e as bactérias compartilham o mesmo código genético, significando que um gene humano pode ser transcrito e traduzido nas bactérias.

No entanto, para um gene humano ser expresso em bactérias, ele deve ter uma modificação importante. Especificamente, ele não deve ter íntrons. Íntrons são sequências intermediárias, encontradas em muitos genes humanos, e eles são removidos dos transcritos de RNA eucarióticos por splicing para fazer um RNAm maduro. As bactérias não têm íntrons e não podem emendar transcritos de RNA.

Como podemos conseguir uma versão de um gene humano com os íntrons removidos? Uma versão sem íntrons de um gene humano pode ser feita de RNAm que codifica o gene, utilizando a enzima transcriptase reversa. A transcriptase reversa sintetiza uma fita de DNA usando um segmento de RNAm como um modelo. Depois de uma etapa adicional para o DNA de dupla-hélice, é produzida uma versão sem íntrons do gene (chamado de chamada um DNAc).

Uma vez que a proteína tenha sido produzida, as células bacterianas podem ser abertas para liberá-la. Existem muitas outras proteínas e macromoléculas flutuando nas bactérias além da proteína alvo (por exemplo, a insulina). Devido a isso, a proteína alvo deve ser purificada, ou separada dos outros conteúdos das células por técnicas bioquímicas. A proteína purificada pode ser usada para experimentos ou, no caso de insulina, administrada aos pacientes.

Bem... sim e não. A insulina recombinante feita por empresas farmacêuticas é na verdade gerada nas bactérias, e é expressa de um plasmídeo portador de um gene de insulina humano modificado. A insulina feita pelas bactérias é purificada usando-se uma coluna de purificação.

No entanto, produzir insulina biologicamente ativa requer algumas etapas adicionais. A insulina é feita como uma cadeia única de polipeptídeos. No entanto, ligações dissulfeto devem se formar dentro da cadeia, e parte dela deve ser cortada para formar duas cadeias separadas (mantidas juntos apenas pelas ligações de dissulfeto). Só então é que a insulina estrá biologicamente ativa, isto é, será capaz de agir como um hormônio no corpo do paciente.

A produção de insulina que pode ser usada por diabéticos exige que estas etapas adicionais sejam incorporadas ao procedimento de purificação de proteínas, para que a proteína insulina tome sua forma tridimensional correta.

Usos da clonagem de DNA

As moléculas de DNA construídas a partir de técnicas de clonagem são utilizadas para vários propósitos em biologia molecular. Uma curta lista de exemplos inclui:

Biofarmacêuticos. A clonagem do DNA pode ser usada para produzir proteínas humanas com aplicações biomédicas, como a insulina mencionada acima. Outros exemplos de proteínas recombinantes incluem o hormônio do crescimento humano, que é ministrado a pacientes incapazes de sintetizá-lo, e o ativador de plasminogênio tecidual (tPA/ APt), que é usado para tratar derrames e prevenir coágulos sanguíneos. Proteínas recombinantes como estas. frequentemente são produzidas em bactérias.
Terapia genética. Em algumas desordens genéticas, os pacientes não possuem a forma funcional de um gene particular. A terapia genética tenta fornecer uma cópia normal do gene para as células do corpo do paciente. Por exemplo, a clonagem do DNA foi usada para construir plasmídeos com uma versão normal do gene que é não funcional na fibrose cística. Quando os plasmídeos foram liberados nos pulmões dos pacientes com fibrose cística, a função pulmonar deteriorou menos rapidamente $^{2}$ ‍.
Análise genética. Em laboratórios de pesquisa básica , os biólogos geralmente usam a clonagem de DNA para construir versões artificiais, recombinantes dos genes que os ajudam a compreender como é a função normal dos genes num organismo.
Por exemplo, pesquisadores estudando neurônios em moscas de fruta podem usar clonagem do DNA para construção de um gene repórter para um gene neural. Nessa construção, a região reguladora (promotor) do gene pode ser colada na frente de um gene que codifica uma proteína fluorescente. Quando transferido para uma mosca, o "gene repórter" seria expresso nos mesmos neurônios como o gene neural em si, fazendo esses neurônios brilharem (fluorescerem) sob a luz UV.

Estes são apenas alguns exemplos de como a clonagem de DNA é usada atualmente na biologia. A clonagem de DNA é uma técnica muito comum usada numa enorme variedade de aplicações de biologia molecular.

Explore além da Khan Academy

Quer saber mais sobre enzimas de restrição? Confira esta atividade interativa e esta simulação do LabXchange.

Quer saber mais sobre o papel da DNA ligase na clonagem de genes? Confira esta atividade interativa e esta simulação do LabXchange.

Quer saber mais sobre transformação bacteriana? Confira esta simulação do LabXchange.

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Este artigo está autorizado sob licença CC BY-NC-SA 4.0.

Referências:

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Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V., ... Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial. Lancet Respiratory Medicine, 3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.

Outras referências:

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Gebel, E. (2013). Making insulin: A behind-the-scenes look at producing a lifesaving medication. In Diabetes forecast. Disponível em http://www.diabetesforecast.org/2013/jul/making-insulin.html?referrer=https://www.google.com/.

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R&D Systems. (2016). Recombinant human growth hormone (GH) protein. In Growth hormone. Disponível em https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-growth-hormone-gh-protein_1067-gh.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology. Em Campbell biology (10th ed., pp. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.

Wilkin, D. (2016, March 23). Gene cloning - advanced. In CK-12 biology advanced concepts. Disponível em http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.

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