Clonagem de DNA e DNA recombinante

RKA8JV Vamos falar um pouco sobre clonagem de DNA, processo que consiste na confecção de cópias idênticas de um pedaço de DNA, geralmente, inclusive, cópias de um pedaço de DNA que codifica algo de interesse, isto é, que irá se expressar como uma proteína útil a um processo determinado. Você pode ter ouvido o termo clonagem em temas como guerras clônicas, de Guerra nas Estrelas, ou como a ovelha Dolly, que são ideias relacionadas. Se você está clonando um organismo, como uma ovelha, você está criando um animal que tem exatamente o mesmo material genético que o organismo inicial, mas quando falamos de clonagem de DNA, estamos falando de algo mais simples, embora seja também muito fascinante. Então, como se faz uma clonagem de DNA? Digamos que esta é uma porção de dupla hélice de DNA em sua forma estirada. Vamos, então, supor que temos nessa região em azul, um gene que desejamos clonar. A primeira coisa que precisamos fazer é cortar esse gene fora da dupla fita de DNA de alguma forma, e a maneira de se fazer isso é pelo uso de enzimas de restrição. Há muitas enzimas de restrição, e eu, pessoalmente, acho fascinante que nós, como civilização, tenhamos chegado ao ponto de encontrar e identificar essas enzimas, sabendo, inclusive, quais pontos de DNA essas enzimas podem cortar, isto é, as enzimas de restrição reconhecem sequências específicas, e assim, podemos escolher as enzimas certas para cortar os pedaços de DNA que desejamos. Então, escolhemos uma para cortar esse pedaço aqui, por exemplo, e outra para cortar esse pedaço aqui, por exemplo. Depois de inserida na mesma solução a dupla fita de DNA e as enzimas de restrição, nós teremos finalmente o segmento desejado, isto é, teremos cortado o gene desejado, separando-o da dupla fita de DNA. Depois de separado o segmento que contém o gene, precisamos colá-lo em um plasmídeo. O plasmídeo é um pedaço de material genético circular de bactérias que, embora seja segregado do cromossomo circular das mesmas, replica-se e se expressa conjuntamente ao material genético cromossômico das bactérias. Note que, tanto o segmento cortado que contém o gene quanto o plasmídeo, são duplas fitas de DNA que apresentam saliências, isto é, trechos um pouco mais extensos em uma fita do que em outra. Esses trechos salientes do plasmídeo podem se complementar aos trechos salientes do DNA, tornando o processo mais fácil. Isso é muito desejado, uma vez que o DNA não é algo que podemos manipular com nossas mãos, copiando e colando como fazemos com fitas adesivas. Tudo isso é feito em soluções, nas quais adiciona-se a dupla fita de DNA que contém o gene juntamente com as enzimas de restrição específicas, que vão liberar o gene desejado e os plasmídeos, com o qual o gênero desejado vai reagir e emparelhar-se. Para catalisar a reação de fechamento da dupla fita de DNA, usamos as enzimas DNA ligase, que irão, então, unir a cadeia principal do segmento de DNA cortado com a cadeia principal de DNA do plasmídeo, colando ambos. Um organismo normalmente utilizado para ceder o plasmídeo é a bactéria Escherichia coli. Suponhamos, então, que temos um tubo de ensaio bem aqui, contendo uma solução com Escherichia coli e também, inseridos separadamente, os plasmídeos, contendo o segmento de DNA que codifica a proteína de nosso interesse. Em um fenômeno que não compreendemos ainda de maneira adequada, as bactérias Escherichia coli, aqui representadas à direita, absorvem os plasmídeos em solução quando aplicamos um choque térmico ao sistema. Uma vez que obtemos nossa bactéria, que contém, inserida em seu material genético, o gene de nosso interesse, precisamos fazer com que ela se multiplique, assim, transferimos a nossa solução de clonagem, na qual algumas bactérias incorporaram o gene de nosso interesse e outras não, para um meio de cultura no qual todas as bactérias irão proliferar. Esse meio de cultura geralmente consiste em uma placa de Petri, contendo nutrientes, logo, cada bactéria vai se proliferar, dando origem a várias colônias. Mas há um problema aqui. Como mencionei, há bactérias que incorporam o plasmídeo e outras não incorporam, deste modo, precisamos selecionar as colônias que incorporaram o plasmídeo e eliminar as que não o incorporaram. Como fazemos isto? A solução para tal seleção consiste em: quando inserimos o gene desejado no plasmídeo, inserimos também um gene para resistência a um determinado antibiótico. Estou colocando esse gene em rosa aqui, um gene aqui, e aqui também. Assim, todas as bactérias que incorporarem o plasmídeo irão carregar, em seu material genético, o gene de nosso interesse, e também a resistência ao antibiótico específico. Finalmente, junto aos nutrientes da placa de Petri, adicionamos o antibiótico ao qual as bactérias certas serão resistentes, logo, apenas as bactérias que incorporaram o plasmídeo serão capazes de sobreviver, ao passo que as que não incorporaram irão morrer na presença do antibiótico. Eu acho incrível que nós, como humanidade, sejamos capazes de fazer esse tipo de coisa. Recapitulando: temos uma determinada proteína de interesse que queremos produzir, assim, encontramos o trecho de DNA que codifica essa proteína e o cortamos com enzimas de restrição específicas. Depois, pegamos esse gene, juntamente com o gene que codifica a resistência ao antibiótico e incorporamos ambos em um plasmídeo com o auxílio da enzima DNA ligase. Em seguida, inserimos o plasmídeo contendo genes em uma solução com bactérias Escherichia coli. Após um choque térmico nessa solução, algumas bactérias incorporam o plasmídeo, então, transferimos a solução para uma placa de Petri com nutrientes e antibiótico determinado, onde apenas as bactérias que incorporaram o plasmídeo irão proliferar, expressando e reproduzindo o gene que codifica a proteína de nosso interesse. Dentre as diversas proteínas que podemos produzir e de fato produzimos, podemos citar a insulina para diabéticos, por exemplo. Podemos usar a maquinaria reprodutiva das bactérias para produzir insulina e aplicar em diabéticos, que carecem dessa insulina. Não estou abordando todos os detalhes de como essa insulina é isolada e como podemos fazer uso dela, mas é realmente muito interessante que podemos produzi-la, que tenhamos chegado a esse ponto.