Eletroforese em gel

RKA8JV Digamos que temos aqui alguns frascos cujas soluções contém fragmentos de DNA. Temos a curiosidade de saber o que acontece no primeiro frasco, o quão longos são os fragmentos, quantos pares de base eles apresentam. Você pode se perguntar: ''por que não tirá-los e contá-los?'' Exceto pelo fato de que eles são de dimensões incrivelmente pequenas e de difícil interação, mesmo um fragmento bastante grande, na ordem de 5.000 pares de base, terá aproximadamente 1 a 2 micrômetros de comprimento, se o esticássemos. Temos essa dificuldade toda mesmo se ignorarmos o quão fino é o diâmetro real, apenas considerando o seu comprimento, ou seja, 1 a 2 µm. Isso é muito pequeno, é 1 a 2 milionésimos de 1 mm. Esticar o fragmento, isto é, tentar manipulá-lo fisicamente com nossas mãos ou com ferramentas grosseiras é uma estratégia que não vai nos ajudar de forma alguma. Então, como vamos fazer isso? A técnica que vamos usar, chamada eletroforese em gel, pode ser utilizada para descobrimos o tamanho tanto de cadeias de DNA quanto de RNA, de proteínas, enfim, de qualquer uma dessas macromoléculas. Ela recebe esse nome pois envolve o transporte gerado por cargas elétricas, que ocorre em um gel, daí o nome eletroforese em gel. O equipamento envolvido na eletroforese em gel está representado aqui. Temos, em seu interior, o gel embebido por uma solução tampão. O gel mais comumente utilizado é o polissacarídeo gelatinoso chamado agarose, extraído de algas marinhas. Então, vou recolher um pouco da amostra 1 e colocar aqui, nessa parte do gel, vou fazer o mesmo com a amostra 2, colocar aqui ao lado, também no gel, e por fim fazer o mesmo com a amostra 3, inserindo ao lado das demais também no gel. Tudo isso está banhado da solução tampão, que é apenas água com um pouco de sal, na qual o pH será mantido dentro de uma faixa de variação aceitável e não irá interferir no DNA, o que poderia acontecer, caso a solução ficasse muito ácida ou muito básica. Agora, vamos aplicar uma voltagem nessa solução contendo gel, de modo que a porção onde inserimos o DNA será o polo negativo e a extremidade oposta será o polo positivo. Você se lembra que, como visto em aulas anteriores, o DNA quando em pH fisiológico apresenta carga negativa devido à presença de grupos fosfatos em sua cadeia principal. O que fazemos com a solução tampão é garantir que o pH fique dentro da faixa fisiológica, garantindo, consequentemente, que o DNA terá carga negativa, assim, quando aplicamos uma voltagem ao sistema, o DNA irá migrar do polo negativo ao polo positivo. Vamos pensar sobre o que vai acontecer então. Lembre-se que a voltagem vai estabelecer uma força elétrica em corpos dotados de carga, conduzindo-os à região de menor potencial. Mas no caso aqui em questão, o DNA é dotado também de massa, estabelecendo uma força gravitacional ao centro da Terra, e não ao polo positivo do gel. Uma vez que a relação de carga por massa é a mesma, quanto menor o fragmento de DNA, menor sua força gravitacional impedindo seu movimento, e então, mais longe o fragmento irá migrar no gel da eletroforese, devido às forças elétricas. Isso tudo faz ainda mais sentido se lembrarmos que o gel de agarose é um polissacarídeo que, em termos moleculares, é uma espécie de malha ou rede, que tende a barrar o avanço das moléculas, ou seja, quanto menor a molécula, mais ela consegue atravessar as lacunas de rede de polissacarídeos da agarose. As pessoas ainda estão estudando o mecanismo exato desse processo, mas, aparentemente, o que determina o quão longe a molécula migra é a sua quantidade de massa, e não sua quantidade de carga. Desta maneira, veríamos após um certo tempo, em nosso gel submetido à tensão elétrica, que as amostras migram cada uma de uma forma, formando diferentes bandas. A amostra representada aqui em azul migrou mais longe que a verde, e essas duas ficaram em posição intermediária entre a representante da amostra laranja. Vemos aqui que a mostra laranja contém bandas que migraram pouco, outras um pouquinho mais, e outras migraram mais que as bandas verde e azul, como essa aqui. Logo, podemos inferir que o menor fragmento está presente na amostra laranja, que migrou mais, assim como que a amostra azul contém fragmentos de DNA menores e mais curtos que a amostra verde. Ainda, os fragmentos da amostra azul e verde são menores que esses dois fragmentos da amostra laranja, uma vez que estes migraram menos e provavelmente são maiores, mais pesados, mais longos. Feito isso, ainda resta saber como realmente medir tais fragmentos. Isso você pode encontrar em soluções padronizadas, que são chamadas de escadas de DNA, representadas aqui no canto em rosa no gel. A escada de DNA contém fragmentos de tamanhos conhecidos, e, conforme a sua migração eletroforese em gel, podemos comparar suas bandas formadas conforme seu alinhamento com as bandas da amostra que estamos estudando. Os fragmentos da escada de DNA, conforme já falei, são padronizados e também rotulados, e você pode escolher qual prefere para comparar. Suponhamos que em nosso experimento comparamos uma amostra de escada de DNA em que o maior fragmento apresenta 5.000 pares de base, o intermediário apresenta 1500 e o menor apresenta 500 pares de base. Então, comparamos nossas amostras e temos uma noção aproximada do tamanho de cada fragmento. Por exemplo, o fragmento azul deve ter entre 500 pares de base e 1.500 pares de base, pois encontra-se em posição intermediária a essas duas bandas rosa. Você pode ter noções cada vez mais precisas conforme a escada de DNA que você insere em seu gel. Outra coisa interessante de se notar é que, quando você vê uma banda, o que ela representa? É apenas uma fita de DNA? Na verdade, a banda é formada por muitas e muitas moléculas de DNA. Lembre-se que um fragmento de 500 pares de base tem algo em torno de 1 a 2 µm, e mesmo se você o esticasse não seria capaz de vê-lo a olho nu. Portanto, a banda é formada por muitas moléculas de DNA, que migram a distâncias muito próximas pelo gel de acordo com a semelhança entre a sua massa quando submetido à voltagem. Agora, a última coisa que você provavelmente está se perguntando é: "como é que eu estou conseguindo ver esse DNA no gel então, uma vez que elas são moléculas tão pequenas?" A resposta é que se coloca o marcador no DNA, tornando-o visível, como um corante ou algo que o torna fluorescente. O marcador típico é o brometo de etídio, que, como você vê aqui, pode ser chamado de agente de intercalação, uma vez que tem a capacidade de intercalar-se entre duas cadeias principais de DNA, como você pode ver aqui à esquerda e à direita. Quando aplicado brometo de etídio ao DNA, a amostra se torna fluorescente sob luz ultravioleta, logo, basta aplicarmos luz UV no gel para observamos as bandas. Se você quiser saber como se parece isso na vida real, temos aqui uma foto de uma eletroforese em gel. Observe à esquerda a escada de DNA, que se inicia aqui e tem a migração de suas bandas com tamanhos padronizados. Talvez, sejam essas as medidas dos segmentos padronizados da escada de DNA. Por exemplo, aqui com 5.000 pb, aqui com 1.500 pb e finalmente, 500 pb, correspondendo às bandas encontradas ao lado dos números. Então, suponha que tenhamos colocado alguma amostra de DNA aqui, e após um tempo seus fragmentos migraram quase tanto quanto a banda padronizada de 500 pb, contendo portanto um pouco mais que 500, mas com certeza muito menos que 1.500 pb. De maneira semelhante, suponha que na mesma amostra, uma certa banda migrou até exatamente aqui, bem na linha de 1.500 pb, indicando que esse é o tamanho desse segmento. Você provavelmente já viu isso, como quando as pessoas falam sobre análise genética, testes de paternidade, todos feitos em eletroforese em gel. E agora você sabe o que realmente está acontecendo aqui. Isso não é uma cadeia de DNA, pois ela é muito grande, você pode vê-la, é, na verdade, várias e várias moléculas de DNA que, com massa semelhante, migram conjuntamente sob efeito da tensão elétrica e formam bandas, cujas posições, depois de um determinado tempo, indicam aproximadamente seu tamanho. Logo, as moléculas de DNA, com suas cargas negativas, migram do polo negativo em direção ao polo positivo, sendo que as menores moléculas alcançam maiores distâncias ao longo da malha de agarose.