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Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Transcrição de vídeo

RKA8JV Vamos falar sobre PCR, a sigla em inglês para o termo "polimerate chain reaction". Isso pode ser traduzido como reação em cadeia da DNA polimerase. Porque fazer PCR? Bom, PCR basicamente faz para várias cópias do pedaço de DNA que você está interessado em estudar. Por que você precisaria fazer várias cópias de um pedaço em particular do DNA? Você pode querer fazer várias cópias para que você possa clonar esse fragmento do DNA em um plasmídeo, e depois fazer alguns outros experimentos com ele. Este é o grande uso. Então, quando nós falamos de clonagem estamos falando sobre colocar um fragmento de DNA dentro de um plasmídeo. Não é como se você estivesse colocando 1 fragmento dentro de 1 plasmídeo, você está fazendo isso com vários, então, você precisa de muitos fragmentos de DNA. Você pode começar com uma pequena amostra de DNA, nesse caso. Você poderia aplicar a técnica de PCR por exemplo, na ciência forense, em diagnósticos médicos, então, este poderia ser, na verdade, o seu DNA, que estaria sendo checado para ver se você tem um gene que poderia te predispor a alguma condição em particular. Enfim, há vários tipos de aplicações práticas. É difícil de identificar apenas um fragmento de um gene, então, uma maneira seria você fazer cópias para amplificar e, assim, você pode correr ele em um gel e ver aquelas moléculas, o quão grande elas são e coisas desse tipo. Se você olhasse apenas para o seu DNA retirado de uma célula, encontrar um fragmento de interesse seria como procurar uma agulha no palheiro, então, esta é a forma como você pode realmente dar um zoom e olhar apenas aquilo que você precisa ver. Eu desenhei alguns diagramas aqui. O que eu desenhei bem aqui é um DNA dupla fita e ele pode ser de uma amostra de cabelo de alguém ou qualquer outro material. Vamos dizer que queremos replicar ou fazer muitas cópias de um fragmento daqui. Então, vamos dizer que o fragmento que realmente nos importa é o fragmento daqui, daqui até aqui. Esta é a parte que queremos fazer várias cópias. Neste caso, ocorre a desnaturação do DNA, a 96°C, este é quase o ponto de ebulição, então é bem quente. E isso separa as duas fitas de DNA, então, uma vez que estão separadas, você pode resfriar um pouco, mesmo que ainda não esteja tão mais frio. 55°C ainda seria uma temperatura bem desconfortável para nós, mas você iria resfriar até 55°C, então estes primers apareceriam. Uma coisa importante de se ressaltar é que esse processo todo está acontecendo dentro de um tubo de ensaio, então, você o esquenta, as duas fitas de DNA se separam e então, estes primers que comentei antes, de onde eles surgem? Bom, você geralmente compra o primer de uma empresa e geralmente você pede muitos, muitos desses primers, então, você coloca vários em sua reação de forma que haja uma grande chance de que, quando você chegue na fase chamada de anelamento, que um primer irá se ligar a vários dos seus pedaços de DNA. Então esta aqui é a nossa solução. Todo esse processo acontece em uma solução de água com sais e outros componentes. Você coloca qualquer que seja sua amostra inicial de DNA aqui, e de novo, é uma amostra bem pequena, você coloca muito daquele primer, muito excedente, vou desenhar em uma cor meio rosa. Você obviamente não o veria assim, você o veria como uma gota de um líquido. Então, você o aquece e as fitas do DNA se separam, e aí quando você o resfria, este primer será específico para o final da região que você quer copiar. Quando você compra, você pede um primer específico, você vai escolher a sequência desse primer para que ele seja específico para a região você quer copiar. Então quando você resfria, o primer se liga às fitas de DNA, e aí, você aquece novamente até os 72°C, onde você os estende. Já que é chamado de cadeia de reação da DNA polimerase, aqui é onde a DNA polimerase está envolvida, é a DNA polimerase que está estendendo isto aqui. Vou desenhar uma DNA polimerase aqui. Bom, essa DNA polimerase não pode ser qualquer DNA polimerase, eu não poderia colocar uma DNA polimerase da minha célula aqui, ela precisa ser uma DNA polimerase especial, porque ela precisa ser resistente ao calor. Como eu mencionei, até a etapa mais fria deste processo não é algo que o seu corpo poderia suportar, então essa DNA polimerase é de um microorganismo tolerante ao calor, é o microorganismo chamado Thermus aquaticus, por isso, essa DNA polimerase é conhecida como Taq DNA polimerase. Este organismo, que é capaz de suportar altas temperaturas, foi achado em fontes hidrotermais, mas isso nos leva então a outra pergunta: por que temos que aquecer a amostra? Bom, isso é porque nós temos que separar as duas fitas de alguma forma. Como não há uma enzima para fazer isso como teria na nossa célula, aquecer faz com que essa separação ocorra, então, de novo, você aquece, as fitas de DNA se separam, e você tem todo esse primer extra. É bem mais provável que esse primer se ligue à fita na sua parte de interesse, do que as duas fitas se unirem novamente, e aí você tem a Taq DNA polimerase. E você a teria adicionado no começo, então, vou adicioná-la aqui, em amarelo. De novo, essas coisas não são robôs, elas não sabem exatamente o que precisam fazer, elas apenas esbarram nas coisas na forma certa e reagem da forma certa. Aqui também você teria que adicionar um tanto de nucleotídeos, então a Taq DNA polimerase, após os primers terem se ligado às fitas de DNA, irá começar a adicionar todos esses nucleotídeos. Esta reação da DNA polimerase continuará acontecendo por algum tempo. Você geralmente escolhe o tempo de duração desta fase para bater com o tempo que você espera que a DNA polimerase precise para completar o fragmento. Então, até agora nós temos, após um ciclo, o dobro daquela sequência do fragmento de DNA que nós queremos, mas nós podemos ter copiado um pouco além de apenas aquela sequência. Então, onde a reação em cadeia entra nesse processo? Você poderia interpretar a reação em cadeia de duas formas: em uma seria o que a polimerase faz, que adiciona nucleotídeos para formar uma cadeia, mas, na verdade, há ainda mais reação à cadeia para adicionar aqui, onde nós estamos tendo um tipo de processo exponencial acontecendo. Então, em um ciclo você chega a essa situação bem aqui, você aquece as fitas do DNA, as fitas do DNA se separam, você resfria, os primers se ligam, e você aquece novamente, a Taq DNA polimerase faz seu trabalho, e como toda polimerase, ela faz no sentido 5', 3', e aí você tem dois fragmentos dupla fita. Com todas aquelas coisas na solução, você pode aquecer tudo novamente, cada uma desses DNA de dupla fita vão virar 4 fitas e você pode resfriar de novo e elas terão primers ligados a elas. E este ainda seria o primeiro primer, porque ainda queremos a mesma sequência de antes. Então, você vai de 1, para 2, para 4 e você continua repetindo isso, tipicamente, você repete até 35 ciclos. Isso depende um pouco do que você está trabalhando, mas você o fará várias vezes. Então, se você está fazendo isso 35 vezes e a cada vez você o multiplica por 2, então seria 2³⁵, o que seria acima de 1 bilhão de fragmentos feitos. O tempo de todos esses ciclos depende do tamanho do fragmento que você quer, porém, geralmente é de 2 a 3 horas. Então, de 2 a 3 horas você pode ir de um fragmento para bilhões, isto, se o processo for completamente eficiente. Uma coisa que pode causar dúvida é: você tem seu primer e a polimerase o estende, assim. Mas como ela sabe aonde parar? Como eu falei, a primeira passagem ela não vai saber onde parar, mas aí quando você começa a ir na outra direção, ela vai chegar a um fim, não vai ter mais nada para copiar, então, a maior parte dos bilhões de fragmentos que você produz terão, no fim, um tipo de corte limpo, apenas aquela sequência que você quer.
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