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Enzimas de restrição e DNA ligase

Digestão por restrição. Extremidades adesivas e coesivas. Reações de ligação.

Pontos Principais:

  • Enzimas de restrição são enzimas que cortam o DNA. Cada enzima reconhece um ou mais sequências alvo e corta o DNA nestas sequências ou perto delas.
  • Muitas enzimas de restrição fazem cortes escalonados, produzindo terminações com DNA fita simples. No entanto, algumas produzem extremidades rombas.
  • DNA ligase é uma enzima de adesão de DNA. Se dois pedaços de DNA tiverem terminações complementares, a ligase pode ligá-las para formar uma molécula de DNA única e contínua.
  • Na clonagem de DNA, enzimas de restrição e DNA ligases são utilizadas para inserir genes e outras frações de DNA em plasmídeos

Como cortar e colar DNA?

Na clonagem de DNA, pesquisadores fazem muitas cópias de um pedaço de DNA, tais como um gene. Em muitos casos, a clonagem envolve a inserção do gene em um pedaço de DNA circular chamado de plasmídeo, que pode ser copiado em bactérias.
Como podem pedaços de DNA de diferentes fontes (tais como um gene humano e um plasmídeo bacteriano) serem unidos para formar uma única molécula de DNA? Um método comum baseia-se em enzimas de restrição e DNA ligase.
  • Uma enzima de restrição é uma enzima que corta DNA que reconhece locais específicos no DNA. Muitas enzimas de restrição fazem cortes escalonados no local de seus sítios de reconhecimento ou perto deles, produzindo terminações de fita simples.
  • Se duas moléculas de DNA têm terminações que se correspondem, elas podem ser unidas pela enzima DNA ligase. A DNA ligase sela o vão entre as moléculas, formando um único pedaço de DNA.
Enzimas de restrição e DNA ligase são frequentemente usadas para inserir genes e outros pedaços de DNA em plasmídeos durante a clonagem de DNA.

Enzimas de restrição

Enzimas de restrição são encontradas em bactérias (e outros procariontes). Elas reconhecem e se ligam a sequências específicas de DNA, chamadas sítios de restrição. Cada enzima de restrição reconhece apenas um ou alguns sítios de restrição. Quando ela encontra suas sequências alvo, a enzima de restrição fará um corte na dupla hélice da molécula de DNA. Normalmente, o corte é no sítio de restrição ou próximo a ele e ocorre em um padrão arrumado, previsível.
Como um exemplo de como uma enzima de restrição reconhece e corta uma sequência de DNA, vamos considerar Eco RI, uma enzima de restrição comum usada em laboratórios. Eco RI corta no seguinte sítio:
Quando EcoRI reconhece e corta este sítio, ela sempre faz isso em uma padrão muito específico que produz extremidades com DNA fita simples.
Se outro pedaço de DNA tiver terminação correspondente (por exemplo, porque ele também foi cortado pela EcoRI), as terminações podem se juntar por pareamento de bases complementares. Por esta razão, diz-se que enzimas que deixam terminações de fita única produzem extremidades pegajosas . Extremidades pegajosas são úteis em clonagem porque seguram dois pedaços de DNA que podem ser ligados pela DNA ligase.
Nem todas as enzimas de restrição produzem extremidades adesivas. Algumas são "cortadoras bruscas" que cortam no meio de uma sequência alvo e não deixam terminação. A enzima de restrição SmaI é um exemplo de enzima que faz cortes bruscos:
Fragmentos com corte perpendicular, sem terminações de fita única, podem ser unidos um ao outro pela DNA ligase. No entanto, fragmentos deste tipo são mais difíceis de se ligarem (a reação de ligação é menos eficiente e mais propensa a falhar) porque não há terminações de fita única para manter as moléculas de DNA na posição.

DNA ligase

Se você aprendeu sobre replicação de DNA, você já pode ter encontrado a DNA ligase. Na replicação de DNA, o trabalho das ligases é unir fragmentos de DNA recém sintetizados para formar uma fita sem emenda. As ligases usadas na clonagem de DNA fazem basicamente a mesma coisa. Se dois pedaços de DNA tiverem terminações complementares, a DNA ligase pode juntá-las para fazer uma molécula intacta.
Como a DNA ligase faz isso? Usando o ATP como fonte de energia, a ligase catalisa uma reação em que o grupo fosfato terminal da extremidade 5' de uma fita de DNA é ligado ao grupo hidroxila terminal da extremidade 3' da outra. Esta reação produz um esqueleto intacto de açúcar-fosfato.

Exemplo: construção de um plasmídio recombinante

Vamos ver como a digestão por restrição e a ligação podem ser usadas para inserir um gene em um plasmídeo. Suponha que temos um gene alvo, ladeado com sítios de reconhecimento da EcoRI, e um plasmídeo, contendo um único sítio EcoRI:
Nosso objetivo é usar a enzima EcoRI para inserir o gene no plasmídeo. Primeiro, nós separadamente digerimos (cortamos) o fragmento do gene e o plasmídeo com EcoRI. Este passo produz fragmentos com extremidades adesivas:
Em seguida, pegamos o fragmento de gene e um plasmídeo linearizado (aberto) e os combinamos com a DNA ligase. As extremidades adesivas dos dois fragmentos unem-se por pareamento de bases complementares:
Uma vez que eles foram unidos pela ligase, os fragmentos se tornam um único pedaço de DNA intacto. O gene alvo agora está inserido no plasmídeo, fazendo um plasmídeo recombinante.

Digestões por restrição e ligações envolvem muitas moléculas de DNA

No exemplo acima, nós vimos um resultado de uma ligação entre um gene e um plasmídeo cortado com EcoRI. No entanto, outros resultados poderiam acontecer nesta mesma ligação. Por exemplo, o plasmídeo cortado poderia recircularizar (fechando-se) sem absorver o gene. Da mesma forma, o gene poderia entrar no plasmídeo, mas virado para trás (uma vez que as duas extremidades adesivas da EcoRI são idênticas).
Digestões por restrição e ligações como essa são executadas usando muitas cópias de DNA do plasmídeo e do gene. Na verdade, bilhões de moléculas de DNA são utilizadas em uma única ligação! Estas moléculas colidem aleatoriamente umas com as outras, e com a DNA ligase, em diferentes maneiras. Portanto, se múltiplos produtos podem ser feitos, todos eles serão feitos com alguma frequência – incluindo aqueles que não queremos.
Como podemos evitar plasmídeos "ruins"? Quando nós transformamos bactérias com DNA de uma ligação, cada uma pega um pedaço diferente do DNA. Nós podemos checar as bactérias após a transformação e usar somente as que possuem o plasmídeo correto. Em muitos casos, o plasmídeo de bactérias modificadas é analisado utilizando outra digestão por restrição para ver se ele contém a inserção certa na orientação certa.

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Quer saber mais sobre enzimas de restrição? Confira esta atividade interativa e esta simulação do LabXchange.
Quer saber mais sobre a DNA ligase? Confira esta atividade interativa e esta simulação do LabXchange.
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