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Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Transcrição de vídeo

vamos falar sobre pcr a sigla em inglês para o termo polímero este é o action isso pode ser traduzido koff reação em cadeia da dna polimerase porque é fazer pcr bom pcr basicamente faz para várias cópias do pedaço de dna que você está interessado em estudar e por que você precisaria fazer várias cópias um pedaço em particular do dna você pode querer fazer várias cópias para que você possa clonar e frango e metro do dna em um plasmídeo e depois fazer alguns outros experimentos com ele este é o grande uso então quando nós falamos de clonagem estamos falando sobre colocar um programa de thenia dentro de um plasmídeo não é como se você estivesse colocando um fragmento dentro de um plasmídeo você está fazendo isso com vários então você precisa de muitos fragmentos de dna e você pode começar com uma pequena amostra de dna nesse caso você poderia aplicar a técnica de pcr por exemplo na ciência forense em diagnósticos médicos então este poderia ser na verdade o seu dna em que estaria sendo checado pra ver se você tem um gene que poderia ter que dispor a max condição em particular enfim há vários tipos de aplicações práticas é difícil de identificar apenas um fragmento de um gênio então a maneira seria se você fazer cópias para amplificar e assim você pode correr ele um gel e ver aquelas moléculas o com grande atuação e coisas desse tipo se você olhasse apenas para o seu dna retirado de uma célula encontrar um fragmento de interesse seria como procurar uma agulha no palheiro então esta é a forma como você pode realmente dar um zoom e olhar apenas aquilo que você precisa ver então desenhar alguns dramas aqui o que desenha bem aqui é um dna dupla fita e ele pode ser de uma amostra de cabelo de alguém ou qualquer outro material então vamos dizer queremos replicar fazer muitas cópias de um fragmento da quitamos dizer que o programa é realmente nos importa o fragmento tac tac até aqui então esta é a parte que queremos fazer várias cópias então neste caso ocorre desde a apuração do dna noventa e seis graus celsius este é quase ponto de ebulição então é bem quente e isso separa as duas fitas de dna é uma vez que estão separados você pode respirar um pouco mesmo que ele não esteja tão mais frio 55 graus celsius ainda seria uma temperatura bem desconfortável para nós mas você respirar até 55 graus celsius então estes primers apareceria uma coisa importante de se ressaltar é que esse processo todo está acontecendo dentro de um tubo de ensaio então você o esquenta as duas fitas de dna separam então estes prémios que comentei antes da onde ele surge bom você geralmente compra o crime é de uma empresa e geralmente você perde muitos muitos desses times então você coloca vários em sua reação de forma que haja uma grande chance de quando você chega na fase chamada de anelamento que um primo irá desligar a vários dos seus pedaços de dna então esta aqui é a nossa solução todo esse processo acontece em uma solução de água com sites e outros componentes você coloca qualquer que seja sua morte disse ao dn aqui e de novo é uma mostra bem pequena você coloca muito daquele pré muito excedente então desenhar uma coisa meio rosa o ceope obviamente não veria assim você veria como uma gota de um líquido então você o aquece e as fitas de dna se separam e aí quando você o refrigerante pra mim está será específico para o final da região que você quer copiar quando você compra você perde um primeiro específico seu específico você vai escolher a recorrência desse plano para que ele seja específico para a região você quer copiar então quando você responderia o programa se liga às fitas de dna e daí você aquece novamente até os 72 graus celsius onde você os existentes e já que é chamado de cadeia de reação daí da dani a polimerase aqui onde a dna polimerase está envolvida é a dna polimerase que está estendendo isso aqui vou desenhar uma dna polimerase aqui bom essa dst ea polimerase não pode ser qualquer dna polimerase eu não poderia colocar uma dna primeiras da minha célula aqui ela precisa ser uma denia polimerase especial porque ela precisa ser resistente ao calor como eu mencionei até a etapa mais fria deste processo não é ao seu povo por poderia suportar então essa dna polimerase de um microorganismo tolerante ao calor é um microorganismo chamado termos aquáticos por isso essa dna de polimerase é conhecida como tac dna polimerase este organismo que é capaz de suportar altas temperaturas foi achado em fontes hidrotermais mas isso leva então a outra pergunta por que temos que aquecer a mostra bom isso é porque nós temos que separar as duas fitas de alguma forma como não há uma enzima para fazer isso como teria nossa célula aquecer faz com que essa separação ocorra então de novo você aquece as filhas de near se separam e você tem todo esse primeiro extra é bem mais provável que esse programa se ligue à fita na sua parte de interesse do que as duas fitas se unirem novamente e aí você tem ataque dna por liberar e você teria adicionado no começo então vou adicionar lakin amarelo então de novo essas coisas não são robôs elas não sabem exatamente o que precisam fazer elas apenas esbarram nas coisas na forma certa e reagem da forma certa aqui também você teria que adicionar um tanto de nucleotídeos então ataque dna polimerase após os pms ter esse ligado às fitas de dna irá começar a adicionar todos esses nucleotídeos esta reação do dna polimerase continuará acontecendo por algum tempo geralmente escolhe o tempo de duração desta fase para bater com o tempo que você espera que a dna polimerase precise para completar o fazer fragmento então até agora nós temos após um ciclo o dobro daquela sequência do fragmento de dna que nós queremos mas nós podemos ter copiado um pouco além de apenas aquela sequência então onde a reação em cadeia entra nesse processo você poderia interpretar a reação em cadeia de duas formas em uma seria que a primeira se faz adicionando criativos para formar uma cadeia mas na verdade ainda mais a reação à cadeia adicionar aqui mas nós estamos tendo um tipo de processo exponencial acontecendo então em um ciclo você chega a situação bem aqui você aquece as fitas de dna as fitas o dna se separam se resfria os premiês i liga e você aquece novamente ataque dna polimerase faz seu trabalho e como toda polimerase ela faz um sentido cinco linhas 3 linha e daí você tem dois fragmentos dupla fita com todas aquelas coisas na solução você pode aquecer tudo novamente cada um dessas dna de dupla fita vão virar quatro fitas e daí você pode respirar de novo e elas terão prêmios ligados a elas e este ainda seria o primeiro prime porque ainda teremos a mesma frequência de antes então você vai de 1 para 2 para 4 e você continua repetindo isso tipicamente você repete até 35 ciclos depende um pouco do que você está trabalhando mas você fará várias vezes então se você está fazendo isso 35 vezes ea cada vez você multiplica por dois então seria 2 elevado a 35 se o que seria acima de 1 bilhão de fragmentos feito o tempo de todos esses ciclos depende do tamanho do fragmento que você quer porém geralmente é de duas a três horas então que duas a três horas você pode ir de um fragmento para bilhões isso se o processo for completamente eficiente uma coisa que pode causar dúvida é você tem seu programa ea polimerase resistente assim mas como ela sabe onde parar como falei a primeira passagem ela não vai saber onde parar mas aí quando você começa na outra direção ela vai chegar a um fim vai ter mais nada para copiar então a maior parte dos bilhões de fragmentos que você produz terão no fim um tipo de corte limpo apenas aquela seqüência que você quer
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