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Conteúdo principal

Fundamentos de gráficos de cinética enzimática

Como interpretar gráficos de cinética enzimática (e como eles são feitos). Km e Vmax. Inibidores competitivos e não competitivos.

Introdução

Vamos imaginar que você está em uma loja de carros esportivos. O que você gostaria de saber para escolher qual é a melhor dentre várias opções (Ferrari, Porsche, Jaguar, etc.) ? Uma característica óbvia seria saber a velocidade que o carro atinge quando acelerado. Mas você talvez queira obter informações mais requintadas, como a rapidez de aceleração do carro de 0 a 60 mph. Em outras palavras, ao invés de apenas saber a velocidade máxima do carro, você também queira a cinética, que é como o carro atinge certa velocidade.
Os bioquímicos costumam pensar da mesma forma sobre as enzimas que eles estudam. Eles querem saber o máximo possível sobre os efeitos de uma enzima sobre a taxa de reação, e não apenas a rapidez de uma enzima em termos de velocidade.
Na realidade, você pode aprender muito a respeito do funcionamento de uma enzima e como ela interage com outras moléculas tais como os inibidores simplesmente medindo a rapidez que ela catalisa uma reação em diferentes condições. Geralmente a informação proveniente destes experimentos é apresentada na forma de gráficos, e por isso iremos conhecer aqui como os gráficos são feitos (e como devem ser lidos para se obter o máximo de informações).

Principais gráficos da cinética enzimática

Gráficos como este mostrado a seguir (representando graficamente a taxa de reação em função da concentração de substrato) são frequentemente usados para exibir informações sobre a cinética enzimática. Eles fornece muitas informações úteis, mas podem ser bastante confusos quando vistos pela primeira vez. Aqui, vamos ajudá-lo passo a passo a entender o processo de construção e de interpretação de um desses gráficos.
Gráfico de cinética enzimática mostrando a taxa de reação em função da concentração de substrato.
Imagem modificada de "Enzymes: Figure 3," de OpenStax College, Biology (CC BY 3.0).
Imagine que você tem um tubo de ensaio com sua enzima favorita e quer saber mais sobre ela, sob diversas condições. Então, você realiza uma série de ensaios nos quais você pega diferentes concentrações de substratos - digamos, 0 M, 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M e 1,0 M - e encontra a taxa de reação (ou seja, a velocidade em que seu substrato é transformado em produto) quando você acrescenta a enzima, em cada caso. É claro que você deve tomar cuidado e acrescentar sempre a mesma concentração de enzima em cada reação, de forma que você compare maçãs com maçãs.
Como se determina a velocidade da reação? Na verdade, queremos a velocidade inicial da reação, quando se acaba de combinar a enzima e o substrato, e a enzima catalisa a reação o mais rápido possível para aquela concentração específica de substrato (posteriormente a velocidade de reação diminuirá para zero conforme o substrato vai sendo utilizado). Portanto, deve-se medir a quantidade de produto produzido por unidade de tempo bem no começo da reação, quando a concentração do produto está crescendo linearmente. Esse valor, a quantidade de produto produzido por unidade de tempo no início da reação, é chamado de velocidade inicial, ou V0, para aquela concentração.
Agora, digamos que você encontrou seus valores de V0 para todas as concentrações de seu interesse. Você pode, então, representar graficamente cada concentração de substrato e seu V0 como um par (X, Y). Depois que representar todos os seus pares (X, Y) no gráfico para diferentes concentrações, pode ligar os pontos com a curva melhor ajustada para obter um gráfico. Para muitos tipos de enzimas, o gráfico que você vai obter lembra a reta roxa mostrada acima: os valores de V0 vão aumentar rapidamente com concentrações baixas de substrato, e depois, vão nivelar em um platô com altas concentrações de substratos.
Gráfico de cinética enzimática mostrando a taxa de reação em função da concentração de substrato, com Vmáx (velocidade máxima) e Km (concentração de substrato produzindo taxa de reação de 1/2 Vmáx) marcada.
Imagem modificada de "Enzymes: Figure 3," de OpenStax College, Biology (CC BY 3.0).
Esse platô acontece porque a enzima está saturada, significando que todas as moléculas enzimáticas disponíveis já estão ocupadas processando substratos. Quaisquer moléculas adicionais de substrato terão que esperar até que outra enzima se torne disponível, por isso a velocidade da reação (quantidade de produto produzido por unidade de tempo) é limitada pela concentração de enzimas. A maior velocidade de reação de uma determinada enzima a uma determinada concentração é conhecida como velocidade máxima, ou Vmax. A Vmax é o valor de Y (valor da velocidade inicial de reação) no qual o gráfico acima atinge o platô.
A concentração de substrato na qual ocorre a reação em um valor mediano da Vmax é chamada de Km, e serve para medir quão rapidamente a velocidade da reação aumenta com a concentração do substrato. A Km é também uma medida da afinidade (tendência de se ligar) de uma enzima com seu substrato. Uma Km menor corresponde a uma maior afinidade pelo substrato, enquanto uma Km maior corresponde a uma menor afinidade pelo substrato. Diferente da Vmax, que depende da concentração enzimática, a Km é sempre a mesma para uma determinada enzima, caracterizando uma determinada reação (embora a Km "aparente", ou experimentalmente medida, possa ser alterada por inibidores, como apresentado abaixo).

Gráficos de cinética enzimática e inibidores

E os inibidores? Já apresentamos dois tipos de inibidores, competitivos e não competitivos, no artigo sobre regulação enzimática.
  • Os inibidores competitivos retardam o progresso da reação ao se ligar à enzima, geralmente no sítio ativo, impedindo que o verdadeiro substrato se ligue. De cada vez, somente o inibidor competitivo ou o substrato pode estar ligado à enzima (e não ambos ao mesmo tempo). Portanto, o inibidor e o substrato competem pela enzima. A inibição competitiva age diminuindo o número de moléculas enzimáticas disponíveis para se ligar ao substrato.
  • Os Inibidores não competitivos não impedem que o substrato se ligue à enzima. Na verdade, o inibidor e o substrato não afetam de maneira nenhuma a capacidade um do outro de se ligar à enzima. Contudo, quando o inibidor está ligado, a enzima não consegue catalisar sua reação para produzir um produto. Assim, a inibição não competitiva age reduzindo o número de moléculas enzimáticas funcionais que podem realizar a reação.
Se quiséssemos mostrar os efeitos desses inibidores em um gráfico como o de cima, poderíamos repetir todo o experimento mais duas vezes: uma vez com uma certa quantidade de inibidor competitivo adicionada à cada reação teste, e outra vez com uma certa quantidade de inibidor não competitivo adicionada. Nós obteríamos os seguintes resultados:
Gráfico de cinética enzimática mostrando a taxa de reação em função da concentração de substrato para uma enzima normal com um inibidor competitivo, e para uma enzima com um inibidor não competitivo. Para o inibidor competitivo, a Vmáx é a mesma que a da enzima normal, mas o Km é maior. Para o inibidor não competitivo, a Vmáx é menor que a da enzima normal, mas Km é o mesmo.
Imagem modificada de "Enzymes: Figure 3," de OpenStax College, Biology (CC BY 3.0).
  • Com um inibidor competitivo, a reação irá atingir sua Vmax normal, mas precisará de uma maior concentração de substrato. Em outras palavras, a Vmax permanece inalterada, mas a Km aparente é maior. Por que se deve adicionar mais substrato para que se chegue à Vmax? O substrato extra torna as moléculas de substrato suficientemente abundantes para "vencerem" bravamente as moléculas inibidoras da enzima.
  • Com um inibidor não competitivo, a reação nunca atinge sua Vmax normal, independentemente de quanto substrato adicionarmos. Uma parcela das moléculas enzimáticas sempre estarão "envenenadas" pelo inibidor, então a concentração efetiva de enzimas (que determina a Vmax) é reduzida. Contudo, a reação atinge a metade de sua nova Vmax na mesma concentração de substrato, portanto a Km permanece inalterada. A Km inalterada mostra que o inibidor não afeta a capacidade da enzima de ligar-se ao substrato, apenas diminui a concentração de enzimas utilizáveis.

Equação de Michaelis-Menten e enzimas alostéricas

Muitas enzimas agem de modo similar à enzima hipotética do exemplo acima, produzindo curvas parabólicas quando a velocidade de reação é grafada como uma função da concentração do substrato. Enzimas que demonstram esse comportamento podem comumente ser descritas por uma equação que relaciona concentração de substrato, velocidade inicial, Km, e Vmax, conhecida como equação de Michaelis-Menten. Enzimas cuja cinética obedece essa equação são chamadas de enzimas Michaelis-Menten. Se você quiser uma visão mais detalhada sobre a equação de Michaelis-Menten e o modelo que a sustenta, talvez você queira ver os vídeos Michaelis-Menten na seção MCAT.
As enzimas de Michaelis-Menten são diferentes das enzimas alostéricas (discutidas no artigo principal sobre regulação enzimática). Enzimas alostéricas têm, tipicamente, múltiplos sítios ativos e geralmente apresentam cooperatividade, o que significa que a ligação de um substrato a um sítio ativo aumenta a habilidade de outros sítios ativos ligarem-se e processarem substratos.
Taxa de reação representada graficamente como uma função da concentração de substrato para uma enzima cooperativa. A curva é em forma de S (sigmoidal), com uma transição brusca da taxa de reação baixa para a alta em uma faixa estreita de concentrações de substratos.
Enzimas cooperativas são mais sensíveis em sua resposta a mudanças nas concentrações do substrato que outras enzimas e apresentam uma transição "do tipo interruptor" da taxa de reação baixa para alta à medida que a concentração do substrato aumenta. Isso corresponde a uma curva velocidade vs. substrato que tem o formato de S, como representado acima.

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